无码国产久久香蕉网在线青草_欧美中文一区亚洲热香蕉导航综合_91久久伊人亚洲热香蕉_亚洲伊人热一本香蕉天久麻豆熟女老司机乱伦

技術文章 / article 您的位置:網站首頁 > 技術文章 > 分子克隆常用技術

分子克隆常用技術

發布時間: 2024-10-09  點擊次數: 172次

分子克隆常用技術  

一、核酸的純化

  在分子克隆的所有操作中,最基本的操作是核酸的純化。其關鍵步驟是去蛋白質,通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每當需要把克隆有某一些所用的酶滅活或去除以便進行下一步時,可進行這種抽提。然而,如要從細胞裂解液等復雜的分子混合物中純化核酸,則要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質后,再用有機溶劑抽提。這些廣譜的蛋白酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K等,它們對多種天然蛋白均有活性,(1)用酚氯仿抽提:這兩種有機溶劑合用,比單獨用酚抽提的除蛋白效果更佳。繼而用氯仿抽提則可除去核酸制品中的痕量酚。①核酸樣品置有蓋小離心管中,加入等體積的酚/氯仿。②旋渦混勻管內容物,使呈乳狀。③12000×g室溫離心15秒。④水相移入另一離心管,棄去兩相界面和有機相。⑤重復步驟①-④步操作,直至兩相界面上見不到蛋白質為止⑦按下述核酸濃縮法沉淀回收核酸。

二、核酸的濃縮

  應用廣的核酸濃縮法是乙醇沉淀法。在中等濃度單價陽離子存在下,加入一定量的乙醇后,所形成有核酸沉淀可經離心而回收,甚至對低至pg量的DNA或RNA,也可定量回收?;厥盏暮怂峥砂此铦舛?,再溶于適當的緩沖液中。
  具體操作時,可向含樣品的小離心管中加入
V/10單價陽離子鹽貯存液2V無水乙醇,混勻,放冰水浴中15-30min,取出目測平衡,0-4度,12000g,離心10min。吸棄上清,再另70%乙醇0.5-1ml,12000g,0-4度洗滌離心2min。吸棄上清,沉淀用油泵抽干或打開蓋子晾干后,溶于適當體積的緩沖液中。

單價陽離子鹽溶液


貯存液(mol/L)

終濃度(mol/L)

(醋酸銨*

7.5

2.0-2.5

LiCl

8.0

0.8

NaCl

2.0

0.2

醋酸鈉

3.0(pH5.2)

0.3

*:當加醋酸銨時,需加入DNA液的V/2。

單價陽離子鹽的選擇,主要基于下述考慮:用醋酸銨可減少dNTP的共沉淀,但在以后要作核酸的磷酸化時應避免用醋酸銨,因銨離子是T,多核苷酸激酶的強烈抑制劑。當用較高濃度的乙醇沉淀RNA時,常用LiCl,因LiCl在乙醇中溶解度很高,不隨核酸共沉淀。含有SDS的核酸樣品,應使用NaCl,這時該去垢劑要70%乙醇中仍保持可溶。DNA和RNA沉淀,大多使用醋酸鈉(pH5.2)。

三、DNA、RNA的定量

  準確的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸樣品是純凈的(即無顯著的蛋白質、酚、瓊脂糖或其它核酸、核苷酸等污染物的制品)。用紫外分光光度計測定260nm和280nm兩個波長處的光吸收,然后,按IA260相當于50μg/ml雙鏈DNA。40μg/ml單鏈DNA或RNA及20μg/ml單鏈寡核苷酸。計算你的樣品含量。260nm280nm兩處讀數的比值(A260/A280),可反映核酸的純度。DNA和RNA純品的A260/A280的值分別為1.8和2.0如果樣品中有蛋白質或酚的污染,則A260/A280將明顯低于此值,此時就無法對樣品中的核酸進行精確定量??蓪悠芳兓笤僮鞫繙y定。有豐富實驗室經驗的人,僅憑樣品電泳后溴化乙錠染色螢光帶的強度,即可大致判斷出樣品中的核酸含量,故他們常不作核酸的紫外分光光度法定量。

四、核酸的凝膠電泳和分子量參照物

(一)瓊脂糖凝膠電泳
  可用于分離、鑒定和提純DNA片段。本法操作簡單、迅速,能分辨其它方法不能分開的DNA片段混合物,分開的DNA可用低濃度的螢光染料(0.5μg/ml溴化乙錠)染色,在紫外燈下直接觀察檢測少至1ng的DNA。
DNA通過瓊脂糖凝膠的遷移率取決于以下參數:①DNA分子的大?。壕€獎雙鏈DNA分子通過凝膠的速率與其分子量的常用對數成反比
。據此用已知分子量的標準物質和待測分子量的DNA片段同時電泳,比較其電泳速率,即可求出待測片段的分子大小。②瓊脂糖濃度:給定大小的DNA片段,以不同速度通過不同濃度的瓊脂擴凝膠。因此利用不同濃度的凝膠,可分辨范圍廣泛,大小不同的DNA片段

不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍

濃度<%(w/v

分離線狀DNA分子的有關范圍(Kb)

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

 

③DNA構型:相同分子量的閉環(Ⅰ型),開環(Ⅱ型)和線狀(Ⅲ型)DNA,以不同速率通過凝膠,一般情況下,遷移率Ⅰ型>Ⅲ型>Ⅱ型。④應用的電壓:在低電壓時,線狀DNA片段的遷移率與所用電壓成正比。但是壓增高時,大分子量DNA片段遷移率的增大是不同的,因此瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨電壓增大而減小。為了獲得DNA片段的最大分辨力,凝膠電泳時電壓不應超過5V/cm。

(二)聚丙烯酰胺凝膠電泳
  可用于分析和制備小于1Kb長度的DNA片段

DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍

丙烯酰胺濃度<%(w>

有效分離范圍(bp

3.5

100-1000

5.0

80-500

8.0

60-400

12.0

40-200

20.0

10-100

聚丙烯胺凝膠多用垂直平板電泳,準備凝膠時,先配制30%單體母液(29克丙烯酰胺,1克雙丙烯酰胺,加水溶解,定容至100ml),再用它來配制所需濃度的凝膠。每100ml上述液體加30μl四甲基乙胺(TEMED),混勻后即可灌注于予先準備好的潔凈不滲漏的凝膠玻板,待凝膠灌至近頂端時,立即插入合適的“梳子",放室溫聚合60分鐘,若冬天室溫太低,則可放37度溫溫箱內,以促進聚合。聚合完成后,拔出“梳子",將凝膠板固定于電泳槽中,向電泳槽傾入1×TBE,用滴管沖洗加樣孔和凝膠底部以除去氣泡,即可加樣電泳。一般所用電壓1-8v/cm,隨時觀察標記染米的遷移。在溶于1×TBE的聚丙烯酰胺中,標記染料遷移速率與下述DNA片段的速率相同

標記染料在PAG中的遷移*

凝膠濃度(%)

溴酚藍

二甲苯腈藍

3.5

100

460

5.0

65

260

8.0

45

160

12.0

20

70

20.0

12

45

*這些數字是與染料共同遷移的DNA片段的近似大?。ㄒ?/span>bp計)。電泳結束,從電槽中取出玻板并小心地撬開,凝膠浸于溴化乙錠液(0.5μg/ml1×TBE)染色,45min后放紫外燈下觀察電泳結果。

(三)分子量參照物
  為了判斷目的DNA片段的大小,常在同一凝膠的目的DNA旁加一分子量參照物,同時電泳并染色后,就能在紫外燈下很快知道目的片段的大小。最*用的分子量參照物是 Hind Ⅲ消化物,各片段的大小以bp表示,分別為:23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125。