人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ⅳ型膠原（Col Ⅳ）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
本試劑盒組成如下：
實驗前，要先進行洗滌，本試劑盒洗滌方法如下：
1.自動洗板機：每孔加入洗滌液350μl，注入與吸出間隔60秒。洗板5次。
2.手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μl，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。洗板5次。
人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。
1.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育2小時。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.棄去液體，甩干，每個孔中加入工作液100μl(在使用前15分鐘內配制)，酶標板加上覆膜，37℃溫育1小時。
3.棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約350μl/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。
4.每孔加工作液(臨用前15分鐘內配制)100μl，加上覆膜，37℃溫育1小時。
5.棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6.每孔加底物溶液100μl，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15分鐘左右(根據實際顯色的情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止)。
7.每孔加終止液50μl，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。
8.立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。
9.實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結束。
當然，要想實驗結果更加可靠，這些事項也是要引起注意的：
1、濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
2、如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔一孔的OD值），請先將樣本稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數（×5×n）。
3、各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其正確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間好控制在5分鐘內，如標本數目多，推薦使用排槍加樣。
4、嚴格按照說明書的操縱進行，人Ⅳ型膠原ELISA檢測試劑盒試驗結果判定須以酶標儀讀數為準。
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